近日，Protein & Cell發表了黃荷鳳院士團隊的最新研究成果：“Biallelic variants in RBM42 cause a multisystem disorder with neurological, facial, cardiac, and musculoskeletal involvement（RBM42雙等位基因變異導致神經、面容⛹🏿♂️、心臟和肌肉骨骼的多系統異常）”（原文鏈接🤟🏻👳🏼：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37294900/）。本研究基於臨床獲得的罕見病例⏏️⛄️，通過家系全外顯子組測序，發現RBM42可能是常染色體隱性遺傳神經發育障礙綜合征的新致病基因🚺。在此基礎上，利用細胞👨🌾🧘🏿♀️、真菌和小鼠模型🌄，研究基因型與表型的相關性⚖️😒。本研究首次將RBM42基因與人類具體疾病相關聯🟥，為進一步了解RNA結合基序蛋白的生物學意義奠定基礎🥁，並為相關疾病診斷和治療提供理論依據。
神經發育障礙 (neurodevelopmental disorders, NDDs) 是一種常見的出生缺陷，表現為大腦發育或功能受損，影響認知👩🏽🚀🛖、語言、情感和運動等正常發育，全球有超過3%的兒童受累。常見的NDDs包括智力障礙、註意力缺陷/多動症、自閉症譜系障礙和癲癇等。大部分NDDs 是綜合征性疾病🙎🏻♂️🐑，除神經系統症狀外，還累及其它系統，尚缺乏有效的治療手段，嚴重影響患者的生存和生活質量🆔🟥，給家庭和社會造成巨大負擔🎉♔。早期的篩查和診斷對NDDs 的預防控製有重要的科學價值和社會意義。高通量測序技術可以檢測到基因組中絕大多數重要變異，也為NDDs 的分子診斷和尋找新的致病基因提供了有效的方法🧱。然而🫶🏽，NDDs 具有高度的遺傳異質性💃🏻，目前仍有超過一半的NDDs 患者未找到明確的遺傳學病因。
本課題組長期致力於出生缺陷相關的遺傳學診斷及機製研究工作😯。前期工作中🧑🏻，我們通過全外顯子組測序，在以中樞神經系統異常👨🏻🎨、特殊面容、先天性心臟病、嚴重發育遲緩等異常為特征的罕見病例中發現RBM42 可能是一個新的常染色體隱性遺傳神經發育障礙綜合征的致病基因🎓。
圖1 先證者的臨床表現
經過對先證者進行染色體核型分析、染色體微陣列檢測和線粒體測序，結果均為陰性。行家系全外顯子組檢測時，在已經的致病基因裏亦未發現可疑的致病位點，但數據再分析時發現先證者存在高度可疑致病變異：NM_024321.5(RBM42):c.[304C>T];[1312G>A], p.[(Arg102*)];[(Ala438Thr)]。RBM42基因編碼RNA 結合基序蛋白42🕰，是一個重要的剪接調控因子🤟，在人體中廣泛表達。目前🕵🏽♀️，對RBM42 基因的研究尚少，其參與疾病的作用機製尚不明確。但是💁🏿♂️，已有研究表明RBM42與引起Au-Kline 綜合征的HNRNPK 基因關系密切🦬。
HNRNPK基因致病性變異引起的Au-Kline 綜合征以常染色體顯性方式遺傳，主要表現為全面發育遲緩👨🔬，張力減退，智力障礙，存在可變的自主神經功能障礙，大多數患者存在先天性心臟病，灰質異位，胼胝體發育不全等。典型的面部特征包括長瞼裂🪦，上瞼下垂，淺眼眶👨🏿🦱，耳突出，耳廓異常，寬鼻翼👩🔧，舌中線深和下垂嘴。其它異常包括顱縫早閉，餵養困難，視力問題🦻🏻🎥，聽力障礙，腎積水🏆，腭異常🈷️，少牙等🏄🏽♀️👆🏼。多學科會診認為RBM42 突變患者表型與Au-Kline綜合征高度重疊🥈，可歸為Au-Kline綜合征的一種亞型。
本研究首先建立了患者家系的LCLs細胞系，發現先證者的RBM42 mRNA和蛋白表達水平均比其父母低🩰。293T的過表達實驗證實，R102*突變導致了無義介導的RNA降解，無最終蛋白產物🔜，A438T突變的表達量也比野生型低。Co-IP實驗進一步證實A438T突變影響了RBM42與HNRNPK的結合。免疫熒光結果說明，突變雖然影響了RBM42的表達🦢，但未改變其與HNRNPK在細胞內的定位。（圖2）
圖2 野生型和突變型RBM42在不同細胞系中的表達情況
之前已有研究表明🌸，人類RBM42是引起小麥赤黴病的禾谷鐮刀菌中pre-mRNA 剪接調節因子FgRbp1 的直系同源物，能夠完全彌補ΔFgRbp1引起的生長缺陷。因此🙌🏼，在此基礎上，本研究構建了突變型的回補載體🧑🏼⚕️，轉化ΔFgRbp1缺陷型禾谷鐮刀菌，觀察菌絲的生長情況。結果發現🏄🏽♀️，ΔFgRbp1::RBM42R102*菌株生長情況與ΔFgRbp1菌株相似，約40%的ΔFgRbp1::RBM42A438T菌株能回復到與野生型相似的生長情況🛌🏿。禾谷鐮刀菌的回補實驗證實R102*是無效變異，A438T是亞效變異👩🏽🏫。
圖3 禾谷鐮刀菌的回補實驗
本研究還利用CRISPR/Cas9技術對單倍體細胞進行基因編輯，基於單倍體精子快速獲得了突變小鼠模型🧑🍳。雙突變小鼠生長發育嚴重受限🧙，且胚胎致死☂️。進一步對E9.5的小鼠胚胎進行了RNA-seq分析，發現變異影響了小鼠神經🌻、心臟發育相關基因的表達和剪接，與患者的主要表型相符🔽，也應證了RBM42主要是通過影響重要的可變剪接事件，進而影響胚胎的正常發育🤽🏿♂️。
圖4 小鼠模型和部分RNA-seq結果
本研究初步證實RBM42是一個新的神經發育障礙綜合征致病基因🖖🏼。臨床評估🙆🏼、遺傳分析、細胞功能實驗和突變模型研究的結果支持RBM42通過影響選擇性剪接，在維持胚胎發育所需的正常細胞生長方面發揮重要作用。
本論文由MK体育平台附屬婦產科醫院黃荷鳳院士、徐晨明研究員、張靜瀾研究員為共同通訊作者，中國福利會國際和平婦幼保健院陳毅瑤、楊秉鑫、中科院分子細胞科學卓越創新中心張曉宇、MK体育平台附屬婦產科醫院陳松長為共同第一作者。中科院分子細胞科學卓越創新中心李勁松院士和浙江大學農業與生物技術學院馬忠華教授對本研究給予大力支持。
